荧光探针检测：揭开荧光探针在科研中的神秘面纱

本文件规定了基于荧光探针监测生物可降解镁基金属降解的试验设计、试验方法、结果评价和试验报告

本文件适用于利用荧光探针监测降解产物包含氢氧化镁的生物可降解镁基金属产品降解全过程的定性和定量体外评价

3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1降解degradation材料的分解。[来源：GB/T16886.9—2022，3.1]3.2降解产物degradationproduct由原始材料化学裂解而产生的颗粒或化学物质。[来源：GB/T16886.9—2022，3.7]3.3腐蚀corrosion化学或电化学反应引起的对金属材料的侵蚀。[来源：GB/T16886.9—2022，3.4]3.4荧光探针fluorescentprobe荧光性质可随所处环境的性质改变而灵敏地改变的一类荧光性分子。4　试验设计4.1概述按附录A制备的荧光探针3-（1-（4-（3-溴丙氧基）苯基）-4-氰基-9-氧代-9H-茚并[2,1-c]吡啶-3-基）亚磺酰基）丙酸（3-((1-(4-(3-bromopropoxy)phenyl)-4-cyano-9-oxo-9H-indeno[2,1-c]pyridin-3-yl)sulfinyl)propanoicacid）（PSPA）在与医用镁合金产品的主要降解产物氢氧化镁（Mg(OH)2）结合时，在特定光源激发下会产生明亮的绿色荧光。运用荧光显微镜或紫外灯等原位监测医用镁合金产品的腐蚀情况，以荧光的有无和强弱判定结果。4.2样品的制备4.2.1　一般要求样品的物理特性（如形状、表面粗糙度等）可影响材料的降解性能，每一样品都应经过相同的处理和清洁过程。4.2.2　样品形状样品宜为圆片状、方片状。4.2.3　样品尺寸样品尺寸宜为直径10?mm、厚度1?mm的圆片或边长10?mm、厚1?mm的方片。4.2.4　结果判定与镁合金腐蚀产物氢氧化镁有荧光反应，即可判定降解程度。5　试验方法5.1概述将样品完全浸泡于腐蚀液中，加入适量按附录A制备的荧光探针PSPA用于镁合金主要降解产物氢氧化镁（Mg(OH)2）的荧光成像或特异性响应，在荧光显微镜或紫外灯下监测医用镁合金产品的腐蚀情况。5.2仪器与试剂正置荧光显微镜：配备405?nm激光器或紫外激光器。手持紫外灯：配备365?nm光源的紫外灯。电子天平：精度0.000?1?g。pH计：最小分辨率0.01?pH。氯化钠（NaCl）。二甲基亚砜（DMSO）。5.3参考监测条件5.3.1参考荧光显微镜观察条件如下：a)曝光时间：10?ms～200?ms之间；b)物镜：10×或20×。5.3.2参考手持紫外灯观察条件如下：a)紫外灯位置：置于镁合金上方10?cm±0.5?cm；b)紫外灯光源：365?nm。5.4溶液制备5.4.1　腐蚀液称取0.900?0?g?NaCl，超纯水溶解并定容至100?mL，配制成浓度为0.9％?NaCl水溶液。5.4.2　荧光探针溶液分别取0.005?g?荧光探针PSPA、928?L?DMSO充分溶解作为储备液，再将该溶液用DMSO稀释10倍，配制成浓度为1?mmol/L荧光探针PSPA的DMSO溶液。5.4.3　供试品溶液分别取0.9％?NaCl水溶液1?980?L、浓度为1?mmol/L荧光探针PSPA的DMSO溶液20?L，充分混合均匀，配制成含荧光探针PSPA腐蚀液。6　结果评价6.1pH对浸泡样品的供试品溶液进行pH值测定（n=3），pH大于9时荧光强度显著增强。6.2降解6.2.1　定性分析将样品浸泡于供试品溶液中，在手持紫外灯（365?nm）下观察，根据绿色荧光的分布情况判定该医用镁合金的降解。注：宜在黑暗中固定角度拍摄照片。6.2.2　定量分析利用荧光显微镜采集样品降解后的荧光图像，运用图像分析系统，按式（1）计算样品表面不同区域的平均荧光强度，平均荧光强度随着时间的变化与样品的降解程度成正相关。　　()式中：——平均荧光强度；——该区域荧光强度总和；——该区域面积。注：宜使用ImageJ软件进行分析。7　试验报告试验报告应包括详细的数据资料，并对结果做出独立评价。试验报告应注明检测机构和检测日期，且应报告下列项目：a)样品：1)分别描述样品的外形、尺寸和数量；2)样品的处理过程，包括所采用的清洗、处理方式等。b)体外腐蚀：1)体外腐蚀液的成分、使用体积；2)腐蚀液中荧光探针PSPA的浓度。c)手持紫外灯观察：样品和参照样品（若有）在手提紫外灯下的荧光分布情况；d)荧光显微镜观察：分别报告样品的荧光分布及降解层厚度随时间的变化；结果评价：对生物可降解镁基金属产品降解定性和定量作出总体体外评价。

本文件规定了焙烤食品中丙烯醛含量测定的荧光法快速测定的原理、试剂和材料、仪器设备、样品制备、试验步骤、试验数据处理、精密度和试验报告等本文件适用于焙烤食品中丙烯醛的测定，方法检出限为1.12μg/kg，定量限为3.92μg/kg4　原理N-乙酸甲酯-4-巯基-1，8-萘酰亚胺中的巯基对萘酰亚胺荧光母核具有PET效应，其本身荧光十分微弱；而当丙烯醛存在的情况下，N-乙酸甲酯-4-巯基-1，8-萘酰亚胺的巯基与丙烯醛通过迈克尔加成反应形成加合产物，使得PET效应被抑制，加合物在波长380nm发射光激发下产生强荧光，峰值在510nm波长处，其荧光强度在固定条件下与待测样品中丙烯醛浓度成正比，使用带荧光检测器的酶标仪检测，外标法定量

荧光探针法测定丙烯醛的原理见图1

图1荧光探针法测定丙烯醛的原理图5　试剂和材料　5.1　试剂除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水

4-溴-1，8-萘二甲酸酐（分析纯）

甘氨酸（分析纯）

三乙胺（分析纯）

乙醇（分析纯）

盐酸（分析纯）

对甲苯磺酸（分析纯）

甲醇（分析纯）

九水合硫化钠（分析纯）

二甲基亚砜（DMSO，分析纯）

柠檬酸（分析纯）

磷酸氢二钠（分析纯）

丙烯醛（分析纯）

5.2　荧光探针的制备将554mg4-溴-1，8-萘二甲酸酐和165mg甘氨酸、252mg三乙胺在80℃的乙醇回流磁力搅拌反应6h，反应完成后冷却至室温，向反应液中加入2.5mL1M盐酸溶液调节pH至白色沉淀析出，经抽滤得到的固体分别用10mL水和乙醇进行洗涤，得到的白色固体即为N-乙酸基-4-溴-1，8-萘酰亚胺；室温下，将167mgN-乙酸基-4-溴-1，8-萘酰亚胺和600mg九水合硫化钠溶解于5mLN，N-二甲基甲酰胺中搅拌反应24h，反应结束后将反应液倒入20mL水中，并用1M盐酸水溶液调节pH至2，有黄色沉淀析出

经抽滤得到的固体用水洗涤五遍后，得到的黄色固体即为N-乙酸基-4-巯基-1，8-萘酰亚胺（Pr-ACR），冷冻干燥，置于-20℃冰箱中备用

5.3　试剂配制柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH为2.2，1mmol/L，15.198g一水合柠檬酸和1.955g十二水合磷酸氢二钠溶解于水中，再用250mL容量瓶定容

探针母液：2.15mgPr-ACR溶于0.5mLDMSO中，制成浓度为150mmol/L探针母液，母液要现配现用

探针工作液：移取50μLPr-ACR母液加入到5mL容量瓶中，用4.3.1的缓冲溶液定容到5mL，工作液要现配现用

5.4　标准品丙烯醛标准品（C3H4O,CAS号：107-02-8）：纯度大于98.0%

5.5　标准溶液的配置用水配制成丙烯醛浓度为30μmol/L的溶液，再用水稀释混匀得到一系列浓度的标准溶液（0μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、18μmol/L、24μmol/L、30μmol/L）

6　仪器设备6.1　酶标仪（带荧光检测器，Ex250-600nm，Em280-600nm)

6.2　96孔板（黑色）

6.3　粉碎机(细度30-100目）

6.4　天平：感量0.00001g

6.5　移液枪（1μL-10μL、10μL-100μL和100μL-1000μL）

6.6　常规玻璃仪器

6.7　离心机（12000转/分，14000×g)

7　试验步骤7.1　准曲线的绘制移取100μL4.3.3中的探针工作液到96孔板中，再加入50μL4.5中不同浓度的丙烯醛标准液，使丙烯醛浓度分别为0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L，摇匀，并置于25℃下反应90min后，置于酶标仪中进行荧光检测，读取波长510nm处的荧光强度值（激发波长为380nm），其荧光发射光谱图见附录A

7.2　样品的制备将1g磨碎的食品粉末加入到15mL离心管中，加入5mL水，搅拌均匀并超声提取20min，再用离心机在10000r/min的转速下离心20min，收集上清液

离心管中的沉淀物质再用2mL水按上述操作重复提取两次，合并3次提取得到的上清液，定容到10mL，备用

7.3　样品的测定　移取100μL4.3.3中的探针工作液到黑色96孔板中，再加入50μL6.2中的样品提取液，摇匀，置于25℃下反应90min后，用酶标仪进行荧光检测，读取波长510nm处的荧光强度值（激发波长为380nm），每次处理重复3次

7.4　空白实验除不称取样品外，均按照上述测定条件和步骤进行

8　试验数据处理样品中丙烯醛的含量按以下公式计算：……………………………………（1）式中：X——样品中丙烯醛的含量，毫克/千克（mg/kg)；56.06——丙烯醛的摩尔质量；C——样品液中丙烯醛的摩尔质量浓度，微摩/升（μmol/L)；V——被测样品的总体积，毫升（mL）；m——称取样品的质量，克（g）

计算结果以重复性条件下获得的3次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字

9　精密度9.1　一般规定本文件的精密度按照GB/T6379.2的规定确定，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算

9.2　重复性在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

9.3　再现性在再现性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

10　试验报告试验报告至少应给出以下几个方面的内容：——试验对象；——所使用的标准；——所使用的方法；——结果；——观察到的异常现象；——试验日期

附录A（资料性）荧光发射光谱图

1、范围2、规范性引用文件3、术语和定义4、原理5、试剂和材料6、仪器设备7、试验步骤8、试验数据处理9、精密度10、试验报告

行业标准《光催化自洁陶瓷性能测试方法 荧光探针法》由中华人民共和国海关总署归口上报，主管部门为海关总署。