氨基丁酸检测：如何科学鉴别其质量与安全性？

本文件适用于混合型饲料添加剂中含量不低于1%的γ-氨基丁酸的测定

本文件规定了混合型饲料添加剂中γ-氨基丁酸测定的高效液相色谱法。

本文件规定了高效液相色谱—串联质谱法测定发芽糙米中γ—氨基丁酸的术语和定义、原理、试剂与材料、仪器与设备、试样制备与保存、分析步骤、结果计算、精密度及其他的要求

本文件适用于发芽糙米中γ—氨基丁酸含量的测定

4　原理试样经甲酸水溶液提取γ—氨基丁酸，用高效液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。5　试剂与材料除非另有规定，使用试剂均为色谱纯。水为GB/T6682中规定的一级水。5.1　试剂5.1.1　甲醇（CH3OH）。5.1.2　甲酸（HCOOH）。5.2　试剂配制5.2.1　0.1%甲酸水溶液：准确吸取1.00mL的甲酸（5.1.2）用水定容至1000mL。5.2.2　甲醇+0.1%甲酸水溶液=1+9（V+V）：取100mL甲醇（5.1.1）和900mL0.1%甲酸水（5.2.1）溶液混合，用滤膜（0.22μm，有机相）过滤后备用。5.3　标准品γ—氨基丁酸标准品（CAS号：56-12-2）：纯度≥99%或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。5.4　标准溶液配制5.4.1　γ—氨基丁酸标准储备溶液：准确称取γ—氨基丁酸标准品（5.3）10.0mg（精确至0.0001g），用水溶解并定容至10mL，此溶液浓度为1mg/mL。储存于4℃冰箱中，有效期3个月。5.4.2　γ—氨基丁酸标准系列工作溶液：将γ—氨基丁酸标准储备溶液（5.4.1）用0.1%甲酸水溶液（5.2.1）配制成2μg/mL标准中间液，再稀释成10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、400ng/mL标准系列工作溶液，临用时配制。6　仪器与设备6.1　液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。6.2　分析天平：感量为0.0001g。6.3　超声波清洗器。6.4　漩涡混匀器。6.5　离心机：转速≥6000r/min。7　试样制备与保存样品混匀后，取200g样品经四分法缩分至约50g，研磨至全部通过孔径0.25mm（60目）筛的试样，装入密封的容器中，室温下保存。8　分析步骤8.1　提取称取0.5g样品（7）（精确至0.0001g）于50mL离心管中，加入10mL0.1%甲酸水溶液（5.2.1），30℃超声提取30min后在漩涡混匀器（6.4）上涡旋2min，于6000r/min离心5min，将上清液转入25mL容量瓶中，样品残渣再用10mL的0.1%甲酸水溶液（5.2.1）重复上述提取步骤提取一次，合并2次提取液，用0.1%甲酸水溶液（5.2.1）定容至25mL，摇匀备用。根据需要用0.1%甲酸水溶液（5.2.1）稀释至标准曲线线性范围内，混匀，经微孔滤膜（0.22μm）过滤待测。8.2　仪器参考条件8.2.1　液相色谱条件a)　色谱柱：C18色谱柱（2.1×150mm，1.7μm），或性能相当者；b)　流动相：甲醇+0.1%甲酸水溶液=1+9（V+V）（5.2.2）c)　进样量：2μL；d)柱温：35℃；e)　流速：0.2mL/min。8.2.2　质谱条件a)　离子源：电喷雾电离源（ESI）；b)　扫描方式：正离子扫描；c)　检测方式：多反应监测（MRM）；d)离子源温度：550℃；e)　气帘气：35psi；f)　离子喷雾电压：5500V；g)　定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能见表1。8.2.3　定性确证按照仪器参考条件测定试样溶液和标准工作溶液，试样中的γ—氨基丁酸质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致（变化范围在±2.5%之内）；且试样中γ—氨基丁酸的两个子离子的相对丰度比（k）与浓度相当标准工作溶液中γ—氨基丁酸的两个子离子的相对丰度比相比，其允许偏差不超过表2规定的范围，则可判定为试样中存在γ—氨基丁酸。γ—氨基丁酸标准溶液质量色谱图参见附录A。允许的最大偏差　±20　±25　±30　±508.2.4　定量测定将标准系列工作溶液按仪器参考条件进行测定，得到相应的标准系列工作溶液的质量色谱峰面积。以标准系列工作溶液的浓度为横坐标，以质量色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制工作曲线，保证样品中γ—氨基丁酸浓度在标准曲线范围内，外标法定量。9　结果计算试样中γ—氨基丁酸的含量按式（1）计算。

本文件描述了食品中γ-氨基丁酸-乙二醛-甲醛加合物的高效液相色谱/质谱测定方法的的原理、试剂和材料、仪器设备、样品制备、试验步骤、试验数据处理、精密度和试验报告本文件适用于焙烤食品中γ-氨基丁酸-乙二醛-甲醛加合物的定性定量测定对含有γ-氨基丁酸-乙二醛-甲醛加合物产品的含量检测可参照使用本文件检出限为4.2μg/kg，定量限为13.9μg/kg4　原理试样用正己烷脱脂后，用20%甲醇/水溶液提取，提取液经减压蒸干后复溶，试样溶液用高效液相色谱/质谱联用仪的多反应监测（MRM）模式测定，外标法定量

5　试剂和材料　5.1　试剂除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水

甲醇（色谱纯）

正己烷（分析纯）

甲酸（色谱纯）

甲醛（分析纯）

乙二醛(glyoxal,GO，分析纯)

γ-氨基丁酸（分析纯）

5.2　试剂配制甲醇/水溶液（20%）：移取50mL甲醇（5.1.1）于250mL容量瓶中，用水定容至刻度

甲酸/水溶液（0.1%）：移取0.25mL甲酸（5.1.3）于250mL容量瓶中，用水定容至刻度

5.3　标准品γ-氨基丁酸-乙二醛-甲醛加合物标准品（C11H16N2O4,CAS号：805228-41-5）：纯度大于98.0%

5.4　标准溶液的配置根据需要，用水配置γ-氨基丁酸-乙二醛-甲醛加合物的浓度为10mg/L的溶液，用水稀释得到一系列浓度的标准溶液（100μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、3000μg/L、4000μg/L）

6　仪器设备6.1　液相色谱仪/三重四极杆质谱联用仪，配有电喷雾离子源（ESI）

6.2　粉碎机(细度30～100目）

6.3　分析天平，感量为0.0001克

6.4　分析天平，感量为0.00001克

6.5　高速离心机（12000转/分，14000×g)

6.6　涡旋器（300rpm～3000rpm）

6.7　常规实验室玻璃器皿

7　试验步骤7.1　样品的制备称取3g粉碎后的样品（过60目筛）于50mL离心管中，加入10mL正己烷没过样品，涡旋5min后于10000rpm下离心10min，重复3次以完全去除油脂，置于通风橱中将残余的正己烷挥干

向离心管中加入15mL20%甲醇/水溶液，涡旋5min后于10000rpm下离心10min，收集上清液，该过程重复2次

将上清液减压蒸干，加20%甲醇/水溶解，定容至5mL

用0.22μm尼龙滤膜过滤，用HPLC-MS/MS的多反应监测模式(MRM)测定样品中γ-氨基丁酸-乙二醛-甲醛含量

7.2　色谱测定7.2.1　高效液相色谱参考条件a）色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶（C18）Aq柱，填料粒径5.0μm，柱长250mm，内径4.6μm，或其他等效色谱柱；b）流动相：A相为含0.1%甲酸/水溶液，B相为甲醇，梯度洗脱程度：0～2min，5%B～95%B；2～8min，95%B～95%B；8min～10min，95%B～5%B；10min～18min，5%B

c）流量：0.4mL/min；d）柱温：40℃

e）进样量：0.5μL

7.2.2　质谱参考条件a）电离方式：阳离子电喷雾电离（ESI+）；b）离子扫描模式：多反应监测模式（MRM）；c）毛细管电压：4000Vd）解簇电压：50Ve）干燥气温度：300℃f）干燥气流量：10L/ming）雾化气压力：50Psih）监测离子范围：m/z50~800

i）定性、定量离子见表1：表1γ-氨基丁酸-乙二醛-甲醛加合物的优化电压参数加合物种类　离子对　碰撞电压（eV）γ-氨基丁酸-乙二醛-甲醛　241/155a241/69241/87　-16-22-22a为定量离子7.2.3　标准曲线的绘制取5.4中的γ-氨基丁酸-乙二醛-甲醛加合物标准溶液（100μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、3000μg/L、4000μg/L），按照色谱参考条件（7.2.1）进行测定，以标准系列中加合物的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线

7.2.4　样品的测定取样品溶液和标准溶液各0.5μL注入液相色谱进行分析，以其标准溶液目标峰的保留时间进行定性，根据峰面积计算样品中待测物质的含量

加合物的总离子流图和质谱图见附录A

7.2.5　空白实验除不称取样品外，均按照上述测定条件和步骤进行

8　试验数据处理样品中γ-氨基丁酸-乙二醛-甲醛加合物的含量，按照公式（1）计算：…………………………………………（1）式中：х——样品中γ-氨基丁酸-乙二醛-甲醛加合物的含量，微克/千克（μg/kg）；C——样品中加合物的浓度，微克/升（μg/L）；V——被测样品的总体积，毫升（mL）；D——样品稀释倍数；M——称取样品的质量，克（g）

计算结果以重复性条件下获得的3次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字

9　精密度9.1　一般规定本文件的精密度按照GB/T6379.2的规定确定，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算

9.2　重复性在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

9.3　再现性在再现性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

10　试验报告试验报告至少应给出以下几个方面的内容：——试验对象；——所使用的标准；——所使用的方法；——结果；——观察到的异常现象；——试验日期

附录A（资料性附录）γ-氨基丁酸-乙二醛-甲醛加合物总离子流图及质谱图

1、范围2、规范性引用文件3、术语和定义4、原理5、试剂和材料6、仪器设备7、试验步骤8、试验数据处理9、精密度10、试验报告

本文件适用于以γ-氨基丁酸为原料，与可溶性淀粉经混合制得的混合型饲料添加剂γ-氨基丁酸本文件规定了混合型饲料添加剂γ-氨基丁酸的技术要求、取样、试验方法、检验规则、标签、包装、运输、贮存和保质期

本文件适用于利用生物酶法转化L-谷氨酸制备的饲料添加剂γ-氨基丁酸本文件规定了饲料添加剂γ-氨基丁酸的技术要求、取样、试验方法、检验规则、标签、包装、运输、贮存和保质期

地方标准《植物类农产品中γ-氨基丁酸的测定》由福建省农业厅归口上报，主管部门为福建省质量技术监督局。本标准规定了植物类农产品中γ-氨基丁酸的测定方法。本标准适用于谷物、茶叶、水果中的γ-氨基丁酸的测定。本方法的最低检出限为12ug/kg。

地方标准《富含γ-氨基丁酸巨胚功能稻高产栽培技术规程》，主管部门为江西省质量技术监督局。

行业标准《氨基酸、氨基酸盐及其类似物 第7部分：γ-氨基丁酸》，主管部门为工业和信息化部。本文件规定了Y氨基丁酸的感官、理化和安全等技术要求，描述了相应的试验方法，规定了检验规则、标志、标签、包装、运输及贮存的内容，并给出了便于技术规定的产品分类以及化学名称、别名、分子式、结构简式和相对分子质量的信息。本文件适用于以L一谷氨酸（钠）为原料，经微生物发酵或生物酶转化、精制、干燥或加入调配辅料制得的γ-氨基丁酸的生产、检验和销售。本文件规定了γ-氨基丁酸的感官、理化和安全等技术要求，描述了相应的试验方法，规定了检验规则、标志、标签、包装、运输及贮存的内容，并给出了便于技术规定的产品分类以及化学名称、别名、分子式、结构简式和相对分子质量的信息。本文件适用于以L-谷氨酸(钠)为原料，经微生物发酵或生物酶转化、精制、干燥或加入调配辅料制得的γ-氨基丁酸的生产、检验和销售。

行业标准《γ-氨基丁酸》由全国食品工业标准化技术委员会归口上报，主管部门为工业和信息化部。本标准规定了γ-氨基丁酸的要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输及贮存。本标准适用于以L-谷氨酸(钠)为原料,经微生物发酵或生物酶转化、过滤、脱色、加入调配辅料喷雾干燥或结晶等步骤生产而成的Y-氨基丁酸。

行业标准《稻米中γ-氨基丁酸的测定 高效液相色谱法》，主管部门为农业农村部。本标准规定了稻米中γ-氨基丁酸含量的高效液相色谱测定方法。本标准适用于稻米中γ-氨基丁酸含量的测定。本方法检出限为0.10mg/kg，定量限为0.20mg/kg。