黄酮检测：科学解析与精准方法

本文件规定了黄芩中黄酮类物质的液相色谱测定方法。本文件适用于液相色谱法测定黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、木犀草素、芹菜素、千层质素A的液相色谱法测定。本文件的方法检出限：黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的方法检出限均为0.075mg/kg，木犀草素、芹菜素的方法检出限均为0.15mg/kg，千层质素A的的方法检出限为0.10mg/kg。

本文件规定了高效液相色谱法测定化妆品中芦丁等6种黄酮类化合物含量的测定方法。本文件适用于水剂类、乳液类、膏霜类、贴面面膜类化妆品中芦丁等6种黄酮类化合物的定性与定量测定。

本文件规定了枸杞中5种黄酮类化合物含量的液相色谱法。本文件适用于枸杞（鲜果）中杨梅素、二氢杨梅素、木犀草素、柚皮素、芸香柚皮素含量的测定和确证。

本文件规定了枸杞中黄酮类物质的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本文件适用于枸杞中芦丁、异槲皮苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6-甲氧基山奈酚-3-O-芸香糖苷和水仙苷的液相色谱-质谱/质谱法测定。本文件的方法定量限：芦丁的方法定量限为1.00mg/kg，异槲皮苷和槲皮素-7-O-葡萄糖苷的方法定量限均为0.010mg/kg，山奈酚-3-O-芸香糖苷、6-甲氧基山奈酚-3-O-芸香糖苷和水仙苷的方法定量限均为0.050mg/kg。

国家标准《饲料添加剂淫羊藿提取物中黄酮醇苷的测定 高效液相色谱法》由TC76（全国饲料工业标准化技术委员会）归口，主管部门为国家标准化管理委员会。

本文件描述了饲料添加剂淫羊藿提取物中黄酮醇苷的高效液相色谱测定方法。
本文件适用于饲料添加剂淫羊藿提取物中5种黄酮醇苷(淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷I)的测定。
本文件中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷I定量限均为0.2 g/kg。

本文件规定了枸杞叶及枸杞茶中总黄酮含量的分光光度计测定方法

本文件适用于枸杞叶及枸杞茶中总黄酮含量的测定

本标准规定了刺梨及其制品中总黄酮含量（以芦丁计）测定的紫外分光光度法本标准适用于刺梨鲜果、刺梨干果、刺梨果脯、刺梨冻干粉、刺梨喷干粉、刺梨原汁、刺梨浓缩汁等刺梨及其制品中总黄酮含量的测定4方法原理黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称

溶于乙醇的黄酮类化合物在弱碱性条件下，与铝盐络合反应后生成有色物质，可在420nm波长附近产生最大吸收

在一定浓度范围内，其吸光度与黄酮类化合物的含量成正比

与芦丁标准品比较，可定量测定黄酮类化合物的含量

5试剂和材料5.1试剂除另有规定外，仅使用分析纯试剂和GB/T6682规定的一级水

5.1.1芦丁（C27H30O16，CAS号：153-18-4）标准品，纯度≥98.0%

5.1.2无水乙醇（C2H6O）

5.1.3硝酸铝[Al.(NO3)3·9H2O]

5.1.4醋酸钾（C2H3KO2）

5.2试剂配制5.2.1芦丁对照品溶液（1mg/mL）：精密称取50mg（精确至0.1mg）芦丁标准品，加少量无水乙醇溶解，转移至50mL容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀

5.2.2硝酸铝溶液（100g/L）：称取Al(NO3)3·9(H2O)17.60g（精确至0.01g），加少量水溶解，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀

5.2.3醋酸钾溶液（98g/L）：称取C2H3KO29.80g（精确至0.01g），加少量水溶解，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀

6仪器和设备6.1紫外分光光度计

6.2高速破壁机

6.3分析天平，感量为0.0001g

6.4超声波提取器

6.5离心机，4000r/min

6.6组织捣碎机

7分析步骤7.1试样制备将刺梨鲜果（3.1）刺梨鲜果去皮、去籽，组织捣碎机打浆，混合均匀，备用；去除刺梨果干（3.2）和刺梨果脯（3.3）中可见杂质，用高速破壁机粉碎，将其制成粉状，备用；刺梨冻干粉（3.4）和刺梨喷干粉（3.5）研磨均匀备用

7.2试样提取7.2.1固态试样：取7.1样品0.5~2g，精密称定（精确到0.0001g），置烘干恒重具塞锥形瓶中，加无水乙醇50mL，称定重量，置于超声波提取器中超声处理1小时（每20分钟摇匀溶液一次），放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液离心10分钟，取上清液，即得

7.2.2液态试样：刺梨原汁（3.6）、刺梨浓缩汁（3.7）等液体样品，精密量取样品1~10mL，置烘干恒重具塞锥形瓶中，加无水乙醇50mL，称定重量，置于超声波提取器中超声处理1小时（每20分钟摇匀溶液一次），放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液离心10分钟，取上清，即得

7.3标准工作曲线准确量取芦丁对照品溶液（5.2.1）0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL分别置于50mL容量瓶中，依次加入硝酸铝溶液（5.2.2）1mL，醋酸钾溶液（5.2.3）1mL，摇匀后加水至刻度

静置1小时后，在420nm处测定吸光度

以50mL溶液中芦丁质量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线

7.4空白试验与试样的测定平行进行，取相同量的所有试剂，采用相同的分析步骤，但不添加试样

7.5试样的测定准确量取提取液（7.2）1.0mL置于50mL容量瓶中，依次加入硝酸铝溶液（5.2.2）1mL，醋酸钾溶液（5.2.3）1mL，摇匀后加水至刻度

静置1小时后，在420nm处测定吸光度

若样品总黄酮含量较高（吸光度不在0.1~0.8之间），可适当稀释后再进行分析测定

8分析结果的表述8.1刺梨鲜果、刺梨干果等固态试样试样中总黄酮含量（以芦丁计）以百分含量（%）表示，按公式（1）进行计算

x=……………………（1）式中:x───试样中总黄酮含量（以芦丁计）；m───由标准曲线查出的样品中芦丁质量，单位为毫克（mg）；M───试样质量，单位为克（g）；d───样品稀释倍数；计算结果保留小数点后两位

8.2刺梨原汁、刺梨浓缩汁等液态试样样品中总黄酮含量（以芦丁计）以百分含量（%）表示，按式（2）计算：x=……………………（2）式中:x───试样中总黄酮含量（以芦丁计）；m───由标准曲线查出的样品中芦丁质量，单位为毫克（mg）；v───试样体积，单位为毫升（mL）；d───样品稀释倍数；计算结果保留小数点后两位

9精密度在重复条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%

本文件规定了蜂胶类保健食品总黄酮含量的测定方法

本文件适用于蜂胶类保健食品中总黄酮含量的测定，其中，固体样品和黏稠样品适用范围为0.13～12.7g/100g，液体样品适用范围为0.013～1.27g/100mL

本文件规定了游离态麦黄酮、总麦黄酮、高麦黄酮小麦的术语、定义和游离态麦黄酮含量、总麦黄酮含量指标及其检测方法本文件适用于小麦籽粒中游离态麦黄酮及总麦黄酮含量的定量测定企业在制定企业标准时可参照使用，相关机构在选育、审定和应用高黄酮小麦及其制品时可参照使用3.1游离态麦黄酮Tricin游离态麦黄酮，又称麦黄酮、苜蓿素、小麦黄素，化学名称为5,7,4’-三羟基-3’,5’-二甲氧基黄酮

游离态麦黄酮具有较强的抗氧化能力，能够调节心血管功能，抑制癌细胞生长，延迟自发性乳腺肿瘤的发生

3.2总麦黄酮Totalwheatflavonoid总麦黄酮，即小麦中黄酮类物质的总含量

黄酮类物质属多酚类化合物，是两个苯环通过三个碳原子相互连接而成的一系列化合物的总称，包含游离态麦黄酮、黄酮苷元及糖苷衍生物

黄酮类物质具有很强的抗氧化和清除自由基的能力，同时具有改善心血管疾病症状、抗癌抗肿瘤、抗菌抗炎、增强人体免疫力等多重功效

3.3高麦黄酮小麦Highflavonoidwheat在小麦生长发育过程中，籽粒中自然产生和积累的游离态麦黄酮含量大于0.5mg/kg（含）或者总麦黄酮含量大于1mg/kg（含）的小麦品种（不含黑、紫、蓝等彩色小麦）

4检测方法4.1小麦籽粒中麦黄酮含量的测定方法高效液相色谱-串联质谱法4.1.1原理　试样用80%乙醇溶液提取，经离心浓缩后复溶，用液相色谱串联质谱仪检测，外标法定量

4.1.2试剂　除另有规定外，水应符合GB/T6682中规定的一级水

4.1.2.1乙醇(CH3CH2OH，CAS号：64-17-5)：色谱纯

4.1.2.2甲醇(CH3OH，CAS号：67-56-1)：色谱纯

4.1.2.3甲酸(HCOOH，CAS号：64-18-6)：色谱纯

4.1.2.4标准品(麦黄酮，Tricin，520-32-1)：纯度≥95.0％

4.1.3溶液配制4.1.3.180%乙醇溶液：取800mL乙醇，加入200mL水，摇匀备用

4.1.3.20.1%甲酸溶液：取1000mL水，加入1mL甲酸，摇匀备用

4.1.4标准溶液配制4.1.4.1标准储备溶液　分别称取5mg标准物质于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，标准溶液避光-40℃保存，保存期为一年

4.1.4.2材料微孔过滤膜（尼龙）：0.22μm

4.1.5仪器和设备4.1.5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)

4.1.5.2离心管：2mL

4.1.5.3分析天平：感量0.1mg

4.1.5.4移液器：1mL

4.1.5.5震动球磨仪

4.1.5.6样品瓶：2mL，带聚四氟乙烯旋盖

4.1.5.7涡旋混合器

4.1.5.8氮气吹干仪

4.1.5.9高速离心机：13000r/min

4.1.5.10超声波清洗仪

本标准规定了沙棘黄酮的要求、检验方法、检验规则、包装、运输、贮存和保质期本标准适用于以沙棘果肉为原料，经食用酒精提取加工而成的沙棘黄酮1总则2规范性引用文件3术语和定义4沙棘黄酮的感观要求（色泽形态、组织状态）5沙棘黄酮主要技术指标确定（沙棘总黄酮含量）6沙棘黄酮梨花指标及确定（水分、灰分）7沙棘黄酮主要卫生指标确定（砷、铅、铜、菌落总数、大肠菌群、霉菌、酵母菌、致病菌）8沙棘黄酮包装、检验规则的确定9沙棘黄酮贮运规范的确定

本文件规定了张家界莓茶总黄酮检测的原理、仪器和用具、试剂与溶液、操作方法及结果计算的方法本文件适用于张家界市莓茶协会成员生产的莓茶的总黄酮测定3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件

3.1张家界莓茶ZhangjiajieAmpelopsisgrossedentata特指生长于张家界行政区域内，经人工栽培种植的显齿蛇葡萄植物，采摘其幼嫩茎叶或成熟绿叶为原料，采用摊青、杀青、揉捻、析晶、干燥等工艺加工而成的代用茶饮品

3.2总黄酮Totalflavonoids指一类具有苯并芘喃环结构的黄酮类化合物的总称，广泛存在于植物界，最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等

显齿蛇葡萄叶中的黄酮类化合物主要为二氢杨梅素

4　原理黄酮类化合物中的3-羟基、4-羟基或5-羟基、4-羰基或邻二位酚羟基，可与铝盐进行络合反应，在碱性液体中生成红色络合物，在一定的浓度范围内，其浓度与吸光度符合比耳定律

显齿蛇葡萄叶中的主要活性成分为黄酮类化合物中的二氢杨梅素,最大紫外吸收波长为291nm，可通过制作标准工作曲线和测定样品的吸光度，计算样品中总黄酮含量

5　仪器和用具5.1仪器紫外可见分光光度计（波长范围190nm～900nm，日本岛津公司）、天平（感量0.001g，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）、水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）

5.2用具容量瓶（10mL,25mL,50mL和100mL）、10mm比色皿

6　试剂与溶液6.1除非另有说明，本文件所用的试剂均为分析纯（AR），水为蒸馏水

6.25%AlCl3溶液：准确称取5.0g无水AlCl3，加入蒸馏水溶解并定容至100mL

6.395%甲醇溶液：量取95mL无水甲醇，向其中加入5mL水，混合均匀

6.4二氢杨梅素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）：纯度≥99.0%（HPLC法），4℃密封避光保存

6.5二氢杨梅素标准品储备液：称取二氢杨梅素标准品15.00mg，加入95%甲醇溶解并定容至25mL

7　操作方法7.1供试样品的制备参照GB/T8303中6.2规定的方法，称取100g左右的显齿蛇葡萄代用茶产品，粉碎成0.85mm（20目）左右的茶粉，混合均匀，每个样品准备三个平行样

7.2测定步骤7.2.1标准曲线的制作分别吸取0.00mL、0.05mL、0.10mL、0.15mL、0.20mL、0.25mL和0.30mL二氢杨梅素标准品储备液置于10mL容量瓶中，加入5%AlCl3溶液3mL，95%甲醇定容至10mL，摇匀后室温避光放置40min，95%甲醇溶液随行空白（即3mL5%AlCl3溶液+7mL95%甲醇），于291nm处测定吸光度

所测吸光度与对应的二氢杨梅素浓度绘制成标准工作曲线（如图1所示）

7.2.2试样母液的制备从7.1中制备的莓茶茶粉中，称取三份样品，每份1.0g，加入100mL95%甲醇，于80℃加热回流提取1h（从甲醇沸腾开始计算时间），得醇提取液，冷却后过滤，将滤液移至100mL容量瓶中，并用95%甲醇溶液定容至100mL

7.2.3试样工作液的制备吸取试样母液2.0mL置于50mL容量瓶中，用95%甲醇定容

7.2.4测定吸取0.5mL试样工作液于10mL容量瓶中，加入3mL5%AlCl3溶液后，用95%甲醇定容至10mL，摇匀，室温避光放置40min，试剂空白液（3mLAlCl3溶液+7mL95%甲醇）作参比，于291nm处测定吸光度

8　结果计算8.1计算方法按照本文件7.2.1的方法制作标准曲线并得到标准曲线方程后，将测定样品的吸光值（Y）代入标准曲线方程中，计算稀释后样品母液中总黄酮的含量（以二氢杨梅素计）/（mg/mL），最终乘以样品稀释倍数50000倍，得到待测定样品中总黄酮含量（以二氢杨梅素计）/（mg/g）

8.2重复性在重复条件下同一样品获得的测定结果的绝对值差值不得超过算术平均值的10%