菌种检测

5　技术要求接种须无菌操作，避免杂菌污染。定期检查菌种培养期间要定期检查培养菌种的培养箱温度和湿度；检查培养器皿的棉塞、盖子和培养基有无生霉现象，如发现异常则立即取出该管重新纯化，经培养后补上空缺；在低倍解剖镜下抽样检查有无螨虫等害虫，发现时须及时消除。6　方法与步骤菌种通常被分为3级。1级种也叫母种或试管种。可用组织分离法或孢子分离法获得母种。2级种也叫原种，是利用母种的菌丝体接入木屑培养基中所产生的菌种。3级种也叫栽培种，是利用原种再扩繁一次所产生的菌种，它直接用于生产，因此也叫生产种。经过母种—原种—栽培种的不断扩大繁殖后，菌丝体的数量越来越多，越来越强壮，利用这样的菌丝体投入生产就可以生长出优良的子实体。母种生产6.1.1　母种培养基制备采用PDA加富培养基制作母种培养基，配方：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、KH2PO41.5～2g、MgSO40.5～1g、10g蛋白胨、水1000mL。配制方法：将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，同时放入20g棉籽壳，煮沸20-30分钟左右至马铃薯酥而不烂时，用6-8层纱布过滤，取滤汁于锅中，加入葡萄糖20g、KH2PO41.5～2g、MgSO40.5～1g、10g蛋白胨、补水至1000mL，加入琼脂熔化，趁热分装于试管中，试管使用直径2厘米，长度20厘米的最优。配制好的培养基用漏斗分装至试管，试管口、壁不粘培养基，塞橡胶塞或棉塞。每7支捆成一捆，管口用牛皮纸包好，直立于灭菌锅内，121℃、0.11～0.15MPa下灭菌30min，待培养基冷却至60～70℃，将其摆成斜面，斜面长度最好占管长的2/3左右比较合适，冷却备用。6.1.2　菌种分离与转管培养菌种分离方法有孢子分离法、组织分离法、菌丝体分离法。孢子分离法是选用当年生无杂菌污染的鲜耳片，以黑、厚、大为佳，经无菌水冲洗几次，用丝线将耳片腹面向下吊挂，另一端吊挂在装有培养基的三角瓶口部，加棉塞封口，在25～28℃温箱中接收孢子并培养成菌丝体。组织分离法是选用优质耳片，表面用75%酒精棉球擦拭2～3遍，用酒精棉包住耳片约2分钟，剪取远离耳基没有筋的部位约0.2平方厘米。在无菌条件下，接入试管斜面培养基上，经25～28℃左右的温度培养长出菌丝体。菌丝体分离法是从黑木耳的段木中分离菌丝体获得菌种的方法。切取火柴头大小的木块，经过消毒，在无菌条件下接入试管斜面，经25～28℃的培养就能长出菌丝体。分离成功的试管母种，还可以在试管斜面培养基上扩大繁殖1～3次，这个过程称为转管或扩管，也叫传代培养。一般1支母种可转30～40支母种，从而满足生产上的需要。转管培养：当培养基温度降至30℃以下时，于无菌室内接种，将菌种用接种钩接入空白斜面培养基，动作迅速、准确。切取菌种时选远离原老菌种的部位，一般培养基两端的活力最强，菌种块大小为1～2mm，块越小菌龄越一致。在菌种分离与转管培养时，要在超净工作台上进行无菌操作，防止杂菌污染。分离或转管几天后在试管斜面上就会长出白色的绒毛状黑木耳菌丝。经过10天左右的培养，菌丝可长满斜面，这就是母种。6.1.3　母种培养母种培养条件为在恒温培养箱内（26±1）℃避光培养，10天左右菌丝即可长好，期间需要定时观察，挑出污染或死亡的母种。菌丝生长健壮、洁白、均匀一致、无杂菌污染的，为优良菌种。原种制备6.2.1　原种培养基制备(1)培养基配方。培养基配方为棉籽壳78%，麦麸20%，蔗糖1%，石膏1%。(2)配制方法。将棉籽壳、麦麸、石膏混合均匀，再加水拌料，使培养料的含水量达到60%左右。测定方法是用手紧握培养料，指缝间稍有水印而不成滴。(3)培养基装瓶与装袋。原种生产使用接种瓶。培养基配好后，即可装入三角瓶中，装至瓶肩，料面压平。培养料在瓶中要求上紧下松，中间使用木锥扎1个孔。瓶口内外要擦净，用棉塞/橡胶塞封口。(4)培养基灭菌。原种装瓶再装入铁筐或塑料筐内准备灭菌。灭菌方法采用高压蒸汽灭菌。采用高压蒸汽灭菌时，锅内在0.15兆帕压力下(锅内温度127℃)灭菌1.5小时。6.2.2　原种接种原种是由母种扩接到原种培养基上而得到的菌种。经过灭菌后的接种瓶或袋，待料温降到30℃以下后，搬入超净工作台或接种室进行接种。接种前，将接种器具、物品搬入接种场所。这些器具和物品主要有接种匙、镊子、酒精灯、酒精棉球、菌种、待接种的料袋。物品放好后，再用紫外线或气雾消毒剂进行熏蒸消毒，40分钟后方可使用。接种时，先点燃酒精灯，将接种用具、菌种表面、接种人员双手用75%酒精擦抹，再将接种针或镊子、菌种棉塞在火焰上灼烧消毒，然后在火焰上将管(瓶)口棉塞/橡胶塞轻轻拔出，斜对火焰，就可进行正式接种。接原种时将每支母种斜面用接种针横划成4-5段，每瓶原种培养基接入一段；接栽培种时，每个培养基瓶内用镊子挟入一小块原种，即每瓶原种一般可接栽培30-40瓶或40-50瓶。6.2.3　原种培养培养场所在使用前也要用气雾消毒剂进行熏蒸消毒。（1）培养温度：一般放置在22℃-25℃的温度下培养，25-60天就可长满瓶。（2）培养湿度：室内相对湿度保持在60%-70%之间，经常保持室内空气新鲜，以利菌丝的生长。如室内空气湿度过大，应在地面上撒些石灰粉，降低湿度，防止病虫杂菌孳生。（3）菌种瓶直立放置：因接入的菌种块还未生长固定，如卧倒叠放，菌种块易落到瓶侧，影响菌种萌发。如生产菌种数量多，应待菌丝萌发并封口后，便可卧倒叠放，以充分利用空间。（4）检查去杂：从菌种萌发定植封口开始就要经常检查有无杂菌污染，发现有杂菌的要及时检出，一般检查工作继续到菌丝体覆盖整个培养基表面为止。（5）保持清洁卫生：培养室内外要经常保持清洁卫生，同时培育期间每隔7-10天，在室内外及瓶口棉塞上喷1%的敌敌畏或其他杀虫药液一次，防止害虫发生。菌种长好后放在低温、干燥、清洁处避光保藏，准备使用。栽培种制备栽培种是由原种扩接到栽培种培养基上而得到的菌种。6.3.1　栽培种培养基制备栽培种培养基配方及制作方法与原种相同，但栽培种一般用塑料袋生产，高压蒸汽灭菌适合使用聚丙烯袋。袋的大小以36厘米×16.2厘米×0.005厘米较为适合。装袋时要保证松紧适当，装袋后使用窝口机进行窝口，插入接种棒。装袋时料袋要轻拿轻放，防止沙粒或杂物将袋刺破引起污染。栽培种培养基装袋后，装入塑料盘中，进入大型高压灭菌锅锅内在0.14兆帕压力下，锅内温度121℃，灭菌3.5小时。6.3.2　栽培种接种栽培种接种方发与原种接种方法一致。6.3.3　栽培种培养栽培种培养与原种一致，但是栽培种不宜再做菌种扩大繁殖。无菌接种操作程序无菌操作一般在超净工作台、接种室中进行，工作量较小时使用超净工作台，而如制作栽培种等工作量较大时需在接种室中进行。操作步骤如下：6.4.1　超净工作台的使用规程首先将超净工作台、接种室收拾干净，放入培养基、菌种、接种用具。超净工作台使用紫外光灭菌30分钟，菌种需要用报纸遮盖，防止紫外光杀死菌种。接种室用气雾消毒粉进行熏蒸消毒，每立方米空间用量1包(5克)，置于容器中点燃，保持40分钟以上。用75%酒精棉擦抹双手。点燃酒精灯，接种工具灼烧灭菌后开始接种。接种时一定要保持无菌操作，培养基接种后移到培养室进行培养。6.4.2　接种室的使用规程①在每次使用前1小时，将所需物品移入接种室，按一定位置摆好，并检查是否齐全。用5%石炭酸溶液在接种室和缓冲室喷雾后，开启紫外线灯照射40分钟；②关闭紫外灯20分钟后进入缓冲室，穿上无菌工作服、鞋、戴好口罩、工作帽，然后用2%煤酚皂液将手浸洗2分钟；③进入接种室，并用5%石炭酸溶液重点在工作台的上方和附近的地面上喷雾。④接种前，用75%的酒精棉球擦手，然后按常规在火焰上进行各项操作。操作时动作要轻捷，尽量减少空气波动，两人操作时要配合默契。用完的火柴杆、废纸不要扔在地上，应放在专用的容器里；⑤工作结束，及时取出接种材料，然后清理台面，将废物拿出室外，再用5%石炭酸全面喷洒，或打开紫外线灯照射半小时；⑥接种时如遇棉塞着火，用手紧握即可熄灭，或用湿布扑灭，切勿用嘴吹灭，以免扩大火焰。如遇培养物或有菌容器打碎散落，应及时用抹布沾5%的石炭酸溶液，收拾擦拭，再用酒精棉球擦手后才可继续操作。

4　要求生产场地4.1.1　基本要求环境应干净整洁、空气优良、通风良好、水源充足且符合GB5749生活饮用水卫生标准、排水畅通、电源充足、交通便利。4.1.2　环境卫生要求应符合NY/T528食用菌菌种生产技术规程的规定。生产设施设备4.2.1　厂房设置和布局应符合NY/T528食用菌菌种生产技术规程的规定。4.2.2　发酵间应按照GB50073洁净厂房设计规范执行，地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，排水坡度1%-1.5%，排水沟必须是圆弧式不锈钢的明沟；墙角为圆角，墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水、易清洗。4.2.3　接种间应按照GB50073洁净厂房设计规范执行，液体菌种接种间设置缓冲间；入口处设置洗手、车间设封闭式废物桶，安装排气管道或者排风设备，门窗应设置防蚊蝇纱网。4.2.4　主要仪器设备应配备水处理设备、液体菌种培养器、空气压缩机、空气过滤器、液体菌种接种器、高压蒸汽灭菌锅、蒸汽锅炉、净化工作台、恒温培养箱、恒温摇床、冰箱、显微镜、磁力搅拌机、磅秤、天平、酸度计等。在经常停电的地方应自备电源（发电机）。4.2.5　主要生产用具应配备玻璃三角瓶、接种机、试管、量杯量筒、玻璃漏斗、培养皿、定量定性滤纸、精密pH试纸等生物实验室常规用品。培养基质原材料应符合NY5099无公害食品食用菌栽培基质安全技术要求的规定。生产品种4.4.1　选用高产、优质、抗逆性强、商品性好的黑木耳品种，使用经省级以上农作物品种审定委员会登记的品种，并且从具有相应技术资质的供种单位引种且种性清楚。4.4.2　菌种生产过程应符合NY/T528食用菌菌种生产技术规程的要求。5　液体菌种生产工艺5.1工艺流程5.2.1　容器使用18mm*180mm或20mm*200mm玻璃试管，试管应保持清洁、干燥。5.2.2　培养基配方马铃薯葡萄糖琼脂培养基（简称PDA培养基）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂20g,水1000mL，PH值自然。综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CPDA培养基）：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，水1000mL，PH值自然。5.2.3　灭菌高压蒸汽灭菌，在121℃，0.11MPa的压力下，维持30min。5.2.4　接种在超净工作台上严格按无菌操作接种。接种完成后，在试管上注明菌种名称、接种时间。5.2.5　培养根据黑木耳菌种的生长要求，给予24℃-25℃的培养温度，保持空气相对湿度65%-75%，避光培养。5.2.6　留样菌种应留样备查，留样的数量应以每个批次母种3支。于4℃-6℃下贮存，贮存至该批菌种出第一潮耳。制备摇瓶液体菌种5.3.1　容器采用1000ml的常规三角瓶，三角瓶应保持清洁、干燥。5.3.2　培养基配方葡萄糖3%，豆饼粉2%，玉米粉1%，酵母粉，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，硫酸镁0.05%，PH值自然。可溶性淀粉3%-6%，蔗糖1%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%，酵母膏0.1%，PH值自然。5.3.3　摇瓶培养基制作按照摇瓶培养基配方称取原料，先称取豆饼粉和玉米粉，混合后用四层纱布包好扎紧，开水煮沸20min,捞出，用四层纱布过滤定容，加入其余的原料至溶解。5.3.4　装液量将制备好的培养基液装入三角瓶中，每瓶装量为400ml，用硅胶塞封口。5.3.5　灭菌同5.2.3高压蒸汽灭菌法。5.3.6　接种将灭菌后的培养基瓶冷却至30℃以下，在超净工作台内接摇瓶种，超净工作台常规消毒后，每瓶在液面接入0.5cm2斜面母种3块～5块，菌种块尽量少带培养基，使菌丝面朝上，菌种块必须漂浮在液面上，接种结束后塞好硅胶塞。5.3.7　培养将接种后的三角瓶放入25℃恒温箱中静止培养2天-3天，待接种块在培养液面生长到1cm时，将该三角瓶放在140转/分钟的回旋式摇床上震荡培养，在培养温度25℃、空气相对湿度65%～75%、避光条件下培养7天后制得摇瓶液体菌种。制备液体菌种专用母种5.4.1　容器采用500ml的常规三角瓶，三角瓶应保持清洁、干燥。5.4.2　专用母种配方杂木屑77%，麸皮20%，红糖2%，石膏1%，料：水=1:1.3，PH值自然。注：杂木屑、麸皮用20目筛子过筛，用过筛后的细碎木屑和麸皮。5.4.3　专用母种培养基制作按照专用母种培养基配方称取原料，将各组分干拌均匀后再加水反复翻拌，直至翻拌均匀。5.4.4　装料量将制备好的专用母种培养基装入500ml的三角瓶内，料面要压平、压实，每瓶装料量450ml,擦净瓶口，塞上硅胶塞封口。5.4.5　灭菌将装料的三角瓶放入高压锅内进行灭菌，在温度达到121℃、压力0.15MPa时开始计时，维持90min。待瓶内温度降至30℃以下是备用。5.4.6　接种在超净工作台内，用灭好菌的吸管将摇瓶液体菌种接入到灭过菌的专用母种培养基上，接种量10ml/瓶。接种完成后，在试管上注明品种名称、接种时间。5.4.7　培养同5.2.5黑木耳菌种培养法。菌丝长满即可备用。5.4.8　贮藏长满菌丝的专用母种当时不用，可放在4℃-6℃冰箱内储藏三个月，便于随时取用。发酵罐检查与清洗5.5.1　检查检查罐上全部阀门、安全阀、压力表、密封垫、管线，要求完好，工作正常。5.5.2　清洗对罐体内外和全部阀门用流水进行冲洗，达到无死角、内壁无任何培养料残余物的清洁程度。5.5.3　空消培养罐初次使用、出现染菌、长期放置、更换品种时，都要求空消灭菌。有内置电加热棒的培养器加水至容积的80%加热至121℃，灭菌40min。用外源蒸汽灭菌的培养器，蒸汽压力达到0.11MPa～0.12MPa、温度121℃～124℃、灭菌40min。液体菌种培养基配方土豆10%；红糖1.5%；葡萄糖1%；麸皮4%；蛋白胨0.2%；磷酸二氢钾0.2%；硫酸镁0.1%；VB1：10mg/L;泡敌0.03%。液体菌种培养基制作按照液体菌种培养基配方称取原料，先称取麸皮，开水煮沸20min,用四层纱布过滤出麸皮，再放入土豆煮至“酥而不烂”，四层纱布过滤，加入其余的原料至溶解。投料与定容打开培养器的上料盖，将配制好的培养基，加适量的水，搅拌均匀，倒入培养器中，加水定容，培养基投料量为罐体总容积的70%-80%，然后拧紧上料盖。培养器实消开启蒸汽阀门对培养器夹层及内层加热，当压力达到0.05MPa时打开培养器的放气阀排放冷气，当放出的蒸汽变直时关闭放气阀。当培养器内蒸汽压力达到0.11MPa-0.12MPa,培养温度达到123℃时开始计时，维持40min后关闭蒸汽进气阀门，打开培养器排气阀门，使得培养器压力缓慢下降（培养器压力不能掉零），此时培养器灭菌结束。注：计时开始时，中间和灭菌结束时需要对培养器进行排料操作。微开接种阀门，有少量气、料排出即可。每次排料时间3-5min，三次共排料3-5L。冷却降温培养基冷却是将灭菌结束后的培养基由123℃降至25℃的过程。打开冷水开关，利用循环冷却水进行冷却降温。在培养料灭菌最后一次排料后，微开培养器进气阀门，启动空压机，操作缓慢进行，使得之前通过过滤器的无菌空气通入培养器内。控制培养器排气阀门使培养器压力控制在0.04MPa给培养器内加压，使培养器内维持负压，尽快使培养液降温至30℃以下。专用种的并瓶用1000ml的三角瓶盛装750ml的水，在121℃-126℃的高压条件下灭菌40min,待水温降至30℃以下时，在超净工作台内将专用母种在无菌条件下捣碎并倒入到无菌水瓶中，制成菌悬液。接种用带有手柄的内经略大于接种口的铁丝缠绕纱布，蘸上95%的酒精，套在接种口上点燃。关闭培养罐进气阀门，打开培养器排气阀，当培养器压力降至0.01MPa以下时，打开菌悬液瓶塞，在火焰上灼烧瓶口30-40秒，打开接种口盖，将菌悬液迅速倒入罐中，迅速盖好接种口盖，拧紧。取下火圈，用湿抹布扑灭。打开进气阀门向罐内通入新鲜空气。液体菌种培养接种结束后，微开排气阀门，是关押升至0.02MPa-0.04MPa，并检查培养温度和空气流量培养温度设定在25℃，通气量6L/min，通气压力0.06MPa。大多数黑木耳品种培养时间为72h-96h。接种24h以后，每隔12h可从接种口取样1次，观察菌种萌发和生长情况。留样与检测5.14.1　留样摇瓶液体菌种样品；培养器灭菌后的空白培养基样品；培养过程中定期从培养器中取出的样品用作镜检和其它理化指标测定。上述样品放4℃冰箱内保存一周以上。5.14.2　无菌检测对上述留存样品应在无菌检测琼脂平板上划线培养，在28℃恒温培养2d-5d，每天观察菌落生长情况，弱化线上没有细菌、霉菌、酵母菌菌落生长，则表明该样品无杂菌。对留样样品应在取样后及时镜检，确定菌丝生长发育状态和有无杂菌污染。液体菌种放罐指标5.15.1　经镜检和其它理化指标等方法检验质量合格即可放光接种。培养温度调节24℃-26℃。5.15.2　感官指标见表1项目　指标菌液色泽　球状菌丝体呈白色，滤液呈棕色菌液形态　菌液稍粘稠，有大量片状或球状菌丝体悬浮、分布均匀、不迅速分层，菌液不混浊。菌液气味　有食用菌液体培养液特有的香气，无异味，乳酸、臭味等。培养器排气口气味正常，无明显改变。表1感官指标5.15.3　理化指标见表2表2理化指标项目　指标PH值　在该品种正常范围内菌丝湿重（g/100ml）　>8显微镜下菌丝形态和杂菌鉴别　可见食用菌菌种液体培养基中特有的菌丝形态，球状和丛壮菌丝大量分布，菌丝粗壮，菌丝内原生质分布均匀、染色剂着色深；无霉菌菌丝、酵母和细菌菌体。留存样品无菌检查　有食用菌菌丝生长，划痕处无霉菌、酵母菌、西菌菌落生长。贮存5.16.1　摇瓶液体菌种保存方法摇瓶液体菌种用牛皮纸包好，放4℃的温度下可保存5d-7d。5.16.2　培养罐液体菌种保存方法15℃-20℃室温可保存1d-2d。

地方标准《野生食用菌种质资源收集和保存规范》由山西省农业标准化技术委员会（SXS/TC 19）归口上报，主管部门为山西省市场监督管理局。

地方标准《蛹虫草液体菌种生产技术规程》，主管部门为辽宁省质量技术监督局。

地方标准《金针菇菌种》，主管部门为四川省质量技术监督局。

地方标准《绿色食品 康县黑木耳菌种生产技术规程》，主管部门为甘肃省质量技术监督局。

地方标准《灵芝菌种生产技术规程》由省农业农村厅归口上报，主管部门为江西省市场监督管理局。

地方标准《茶树菇菌种鉴定技术规程》由省农业农村厅归口上报，主管部门为江西省市场监督管理局。

地方标准《桑黄生产技术规程 第2部分：菌种制备》，主管部门为湖北省市场监督管理局。

地方标准《灰树花菌种》，主管部门为湖北省市场监督管理局。

地方标准《茶树菇液体菌种生产技术规程》由省农业农村厅归口上报，主管部门为江西省市场监督管理局。

地方标准《平菇固体菌种生产技术规程》由陕西省农业农村厅归口上报，主管部门为陕西省市场监督管理局。

本规程规定了高原羊肚菌菌种制作的术语与定义，主要包括高原羊肚菌母种（一级种）、原种（二级种）、栽培种（三级种）的制作方法；菌种培养基原材料选择、原材料配方比例、羊肚菌菌种接种（转接）、羊肚菌菌种菌丝培养等

本规程适用于青海高原地区羊肚菌菌种制作方法

主要包括高原羊肚菌母种（一级种）、原种（二级种）、栽培种（三级种）的制作方法；菌种培养基原材料选择、原材料配方比例、羊肚菌菌种接种（转接）、羊肚菌菌种菌丝培养等。

地方标准《黑木耳液体菌种生产技术规程》，主管部门为辽宁省质量技术监督局。

地方标准《竹根姜无菌种苗生产技术规程》由重庆市农业委员会归口上报，主管部门为重庆市质量技术监督局。