耐药性检测

行业标准《水产养殖动物细菌耐药性调查规范 通则》，主管部门为农业农村部。本文件界定了水产养殖动物细菌耐药性调查规范的术语和定义，确立了水产养殖动物细菌耐药性调查流程，规定了细菌耐药性调查中样品采集、信息采集、细菌分离鉴定、菌株保存、药物敏感性试验、结果判定和结果记录与统计的要求，描述了上述各步骤相应追溯或证实的方法。本文件适用于水产养殖动物细菌对渔用抗菌药物的耐药性调查。

本文件规定了畜禽养殖场细菌耐药性水平评价的设备和材料、样品采集、菌株分离与药物敏感性试验、评价对象、评价方法、记录和生物安全的要求。本文件适用于猪、鸡、鸭等畜禽养殖场的大肠埃希菌和肠球菌（屎肠球菌或粪肠球菌）耐药性水平评价。

行业标准《动物源细菌耐药性监测样品采集技术规程》，主管部门为农业农村部。

行业标准《动物及其制品中细菌耐药性的测定 纸片扩散法》由国家认证认可监督管理委员会归口上报，主管部门为国家质量监督检验检疫总局。

本文件规定了纸片扩散法检测畜禽源细菌耐药性的方法。本文件适用于从畜禽及其产品中分离的大肠埃希氏菌、沙门氏菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌耐药性的纸片扩散法检测。

本文件规定了畜禽养殖环节细菌耐药性监测的设备和材料、试剂和培养基、样品采集与保存、细菌分离鉴定与保存、抗菌药物敏感性试验、生物安全的要求。本文件适用于畜禽源的大肠埃希氏菌、肠球菌和弯曲杆菌分离鉴定，及其抗菌药物敏感性试验（微量肉汤稀释法）。

本指南规定了细菌生物被膜培养、观测和耐药性评测技术的实验条件要求、实验设计、实施与验证等技术要求本指南适用于研究机构、教育机构以及其他生物技术相关机构或公司内需培养、观测细菌生物被膜，并检测细菌生物被膜耐药性的实验操作人员阅读并参考使用本指南亦适用于临床和食源性分离细菌菌株生物被膜形成能力的鉴定、临床和食源性分离菌株生物被膜耐药性的测定、细菌生物被膜形成和耐药分子机制的探究、细菌生物被膜防控方法及药物的研发等领域本指南可作为实验室细菌生物被膜培养与构建、观测与定量、以及耐药性评估等工作的技术依据根据《中华人民共和国专利法》，对于本指南中所涉及专利技术（US9988380B2，US10416153B2，ZL201711231930.8，CN110974838A）的使用，需获得专利权所有人书面许可细菌生物被膜培养方法与技术标准以下生物被膜培养方法与技术标准均以铜绿假单胞菌为模式菌株撰写，其他菌种培养以及实验条件可按需求适当调整。铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）是一种常见的革兰氏阴性条件致病菌，在正常人皮肤、呼吸道、肠道以及多种自然环境如水、土壤中广泛分布。此菌为杆状单鞭毛形态，适宜生长温度为25-37℃，在42℃也可生长，于LB培养基上呈青绿色圆形菌落且极易附着在不同基质表面形成生物被膜。铜绿假单胞菌是医院内感染的主要致病菌之一，可在免疫力低下的患者不同部位形成生物被膜引起长期慢性感染，包括烧伤伤口感染、呼吸道感染和尿路感染等，并可引发菌血症和败血症等致命并发症。此菌对多种抗生素耐药，并且耐药机制非常复杂，包括形成生物被膜、加强外排泵系统、改变细胞膜通透性与药物作用靶点、以及分泌抗菌酶等。铜绿假单胞菌生物被膜的形成机制也相当复杂，例如通过过量分泌胞外多糖、积累胞外DNA、降低运动能力、调节群体感应系统等。作为研究生物被膜的模式菌株，铜绿假单胞菌早已被广泛应用于构建生物被膜、检测其耐药性并开发用药方案的研究中，是以本指南以铜绿假单胞菌为模式菌株撰写，其他菌种的培养及实验条件可按需适当调整以达到最佳实验结果。4.1体外静态生物被膜培养本指南囊括四种常用的体外静态生物被膜培养方法，包括孔板培养法、玻璃珠培养法、玻片培养法和Peg-lid培养法。（1）孔板培养法（4.1.1）将稀释菌液在96孔板或24孔板中培养，生物被膜附着于孔壁上，移除悬浮液并洗脱浮游菌体可得到生物被膜用于后续实验。孔板培养法一般用于检测菌种生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐药性和药物最小抑菌浓度等实验。此培养法可与多种染色法结合用于定量生物被膜，培养出的生物被膜结构可用不同显微镜观察。此培养法具有通量高、培养时间短和操作简单等优势，但培养的生物被膜厚度与硬度较低，浮游菌体不易洗脱造成平行间差异较大。（2）玻璃珠培养法（4.1.2）在24孔板中将玻璃珠置于稀释菌液内培养，生物被膜附着于玻璃珠表面，洗脱浮游菌体可得到生物被膜用于后续实验。此培养法与孔板培养法类似，一般用于检测菌种生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐药性和药物最小抑菌浓度等试验。此培养法可与多种染色法结合用于定量生物被膜，但不易在显微镜下观察。此培养法具有通量高、培养时间短等优势，但操作略复杂。此方法培养的生物被膜厚度与硬度较高，浮游菌体较易清洗，平行间差异较小。（3）玻片培养法（4.1.3）将玻片插入菌液培养，生物被膜附着于玻片表面，去除拨片并洗脱浮游菌体得到生物被膜用于后续实验。此方法一般用于检测菌种生物被膜形成能力、观察生物被膜结构与形态，可与多种染色方法和多种显微镜结合使用观测生物被膜构态。此方法通量高、培养时间短，但操作略复杂。此方法培养的生物被膜量较大、厚度与硬度高，浮游菌体易清洗，平行间差异较小。（4）Peg-lid培养法（4.1.4）将带有凸起楔子（peg）的96孔板盖置于装有菌液的96孔板中培养，生物被膜附着于peg中下端，取下盖子并洗脱peg上的浮游菌体可得到生物被膜用于后续实验。此方法与孔板培养法类似，一般用于检测菌种生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐药性和药物最小抑菌浓度等试验。此培养法可与多种染色法结合用于定量生物被膜，但培养出的生物被膜由于在楔子顶端，不易于显微镜观察。此培养法具有通量高、培养时间短和操作简单等优势，培养的生物被膜厚度与硬度较高，浮游菌体较易洗脱、平行间差异较小。每种培养与观测方法细节请见下文。4.1.1孔板培养法适用范围：孔板生物被膜培养法通常适用于以下场景：（1）需要检测不同菌种（野生菌种和突变菌种）间生物被膜形成能力，（2）需要检测不同菌株在生物被膜状态下对药物的敏感/耐受性。针对孔板培养的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章节5.1.2a）、生物被膜耐药性和药物最小抑菌浓度（章节6.1）。以下示意装置和操作均以铜绿假单胞菌（PA）为模式菌株，在耗氧培养条件下进行示例：图1.体外静态生物被膜培养方法（孔板培养法）4.1.1.1实验材料：a.无菌96孔板（或24孔板,Nest/Corning）；b.无菌储液器；c.100μL排枪移液器（或1mL移液器）；d.15mL无菌摇菌管；e.100μL（或1mL）移液器枪头；f.LB培养基（可按需使用其他培养基）；g.所需菌株；h.废液桶；i.75%酒精；j.无菌ddH2O；k.无菌生理盐水。4.1.1.2培养步骤【附录以protocol/SOP模式进行详细阐述】首先将目标菌株接种至LB培养基中培养过夜。在无菌操作台中，用新鲜培养基将菌液按一定比例稀释，随后将稀释好的菌液倾倒入无菌储液器，再用排枪移液器将稀释菌液加入96孔板或24孔板孔洞中，并置于所需温度下静置培养生物被膜。实验菌种和对照菌种均按照附录Xa的培养步骤进行接种、培养（附录Xa），随后对生物被膜进行分析（章节5）。4.1.1.3技术要点a.所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染；b.在将菌液加入孔板前，轻轻摇晃储液器将菌液混合均匀，并用排枪反复轻轻吹打菌液，以减小实验误差；c.孔板培养生物被膜需保证培养后孔洞内剩余菌液体积基本一致，培养时需用透气封口膜密封孔板防止液体蒸发；d.移除废液以及清洗生物被膜时须注意不可用枪头触碰生物被膜，以保证生物被膜完整性。4.1.2玻璃珠培养法适用范围：玻璃珠生物被膜培养法通常适用于以下场景：（1）用于循环培养生物被膜进行压力条件进化实验，（2）需要检测不同菌株在生物被膜状态下对药物的敏感/耐受性。针对玻璃珠培养的生物被膜的分析方法主要为：CFU计数法（章节5.3.2b）。以下示意装置和操作均以铜绿假单胞菌（PA）为模式菌株，在耗氧培养条件下进行示例：图2.体外静态生物被膜培养方法（玻璃珠培养法）4.1.2.1实验材料：a.无菌24孔板；b.无菌储液器；c.1mL移液器d.15mL无菌摇菌管；e.1mL移液器枪头；f.LB培养基（可按需使用其他培养基）；g.无菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理盐水）；h.所需菌株；i.废液桶；j.75%酒精；k.镊子；l.3-5mm玻璃珠。4.1.2.2培养步骤【附录以protocol/SOP模式进行详细阐述】首先将目标菌株接种至LB培养基中培养过夜，用新鲜培养基将菌液按一定比例稀释，随后将稀释好的菌液转移至24孔板孔洞中，并加入两颗无菌玻璃珠，37℃100rpm转速摇晃培养过夜。实验菌种和对照菌种均按照附录Xa的培养步骤进行接种、培养（附录Xb），随后对生物被膜进行分析（章节5）。4.1.2.3技术要点a.所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染；b.在将菌液加入孔板前，轻轻摇晃储液器将菌液混合均匀，并用移液器反复轻轻吹打菌液，以减小实验误差；c.孔洞内菌液不可过多，以免摇晃培养时菌液溅出造成交叉污染；d.用无菌镊子转移玻璃珠时，需尽量减少镊子与玻璃珠接触面，以保证生物被膜完整性；e.孔板培养生物被膜需保证培养后孔洞内剩余菌液体积基本一致，培养时需用透气封口膜密封孔板防止液体蒸发。4.1.3玻片培养法适用范围：玻片生物被膜培养法通常适用于以下场景：（1）需要检测不同菌种（野生菌种和突变菌种）间生物被膜形成能力，（2）需要检测不同菌株在生物被膜状态下对药物的敏感/耐受性。针对玻片培养的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章节5.1.2c）和生物被膜耐药性（章节5.3.2c）。以下示意装置和操作均以铜绿假单胞菌（PA）为模式菌株，在耗氧培养条件下进行示例：图3.体外静态生物被膜培养方法（玻片培养法）4.1.3.1实验材料：a.无菌培养皿（静置培养需准备6孔板）；b.15mL无菌摇菌管；c.LB培养基（可按需使用其他培养基）；d.无菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理盐水）e.所需菌株；f.废液桶；g.75%酒精；h.镊子；i.载玻片。4.1.3.2培养步骤【附录以protocol/SOP模式进行详细阐述】首先将目标菌株接种至LB培养基中培养过夜，用新鲜培养基将菌液按一定比例稀释，随后将稀释好的菌液转移至培养皿，并加入无菌载玻片，37℃100rpm转速摇晃培养过夜。实验菌种和对照菌种均按照附录Xa的培养步骤进行接种、培养（附录Xc），随后对生物被膜进行分析（章节5）。4.1.3.3技术要点a.所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染；b.培养皿内菌液不可过多，以免摇晃培养时菌液溅出造成污染；c.用无菌镊子转移载玻片时，需尽量减少镊子与玻璃珠接触面，以保证生物被膜完整性；d.摇晃培养时需用透气封口膜密封培养皿防止液体蒸发。4.1.4Peg-lid培养法适用范围：Peg-lid生物被膜培养法通常适用于以下场景：（1）需要检测不同菌种（野生菌种和突变菌种）间生物被膜形成能力，（2）需要检测不同菌株在生物被膜状态下对药物的敏感/耐受性。针对Peg-lid培养的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章节5.1.2c）和生物被膜耐药性（章节5.3.2c）。以下示意装置和操作均以铜绿假单胞菌（PA）为模式菌株，在耗氧培养条件下进行示例：图4.体外静态生物被膜培养方法（peglid培养法）4.1.4.1实验材料：a.96孔板；b.Peglid盖子（见附录图三）;c.无菌储液器；d.100μL排枪移液器；e.15mL无菌摇菌管；f.100μL（或1mL）移液器枪头；g.LB培养基（可按需使用其他培养基）；h.所需菌株；i.废液桶；j.75%酒精；k.无菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理盐水）；l.无菌生理盐水。4.1.4.2培养步骤【附录以protocol/SOP模式进行详细阐述】首先将目标菌株接种至LB培养基中培养过夜，用新鲜培养基将菌液按一定比例稀释，随后将稀释好的菌液转移至96孔板中，再将peglid小心盖入菌液中。37℃100rpm转速摇晃培养过夜。实验菌种和对照菌种均按照附录Xa的培养步骤进行接种、培养（附录Xd），随后对生物被膜进行分析（章节5）。4.1.4.3技术要点a.所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染；b.在将菌液加入孔板前，轻轻摇晃储液器将菌液混合均匀，并用排枪反复轻轻吹打菌液，以减小实验误差；c.孔洞内菌液不可过多，以免置入peglid或震荡培养时菌液溅出造成污染；d.需保证培养后孔洞内剩余菌液体积基本一致，培养时需用透气封口膜密封孔板防止液体蒸发；e.移除废液以及清洗生物被膜时须注意不可触碰生物被膜，以保证生物被膜完整性。4.2体外动态生物被膜培养本指南囊括两种常用的体外静态生物被膜培养方法，包括管式培养法和池式培养法，详细介绍如下：（1）管式培养法将菌液注入硅胶管内静置附着后，将培养基以匀速注入硅胶管，流动培养生物被膜，生物被膜附着于管壁上。此方法一般应用于对生物被膜样品需求量大的实验，如生物被膜样品收集，胞外多糖收集生物转化（biotransformation）等。此方法可形成大量生物被膜，生物被膜结构厚，通量较高，但培养时间较长，操作较复杂，并不易用显微镜观察生物被膜结构。（2）池式培养法将菌液注入培养池通道内，翻转静置待细菌附着与盖子上之后，将培养基以匀速注入培养通道，流动培养生物被膜，生物被膜附着于三通道池盖上。此方法一般应用于生物被膜形态观察、药物对生物被膜形态的影响等实验，此方法形成生物被膜形态与结构完整，可结合有荧光标记的菌株或不同染色法，直接在显微镜下观测生物被膜形态与结构，但通量较低，操作复杂，培养时间较长。4.2.1管式培养法（tubing-biofilm）适用范围：管式生物被膜培养法通常适用于以下场景：（1）需要模拟管道内生物被膜生长环境的研究，（2）需要相对大量生物被膜样品的研究，（3）生物被膜对药物/化合物代谢（biotransformation）的相关研究等。针对管式培养的生物被膜的分析方法主要包括：干重/湿重分析（章节5.4）、基因组/转录组/蛋白组提取和测序分析、电子显微镜观察（章节5.7）、氧气探针/化合物探针监测等。以下示意装置和操作均以铜绿假单胞菌（PA）为模式菌株，在耗氧培养条件下进行示例：管式生物被膜培养法具有较高通量，可以一次性培养多通道生物被膜样品；该方法能够一次性产出大量生物被膜样品，常用于干重/湿重分析、基因样本提取，EPS等代谢产物提取、电子显微镜观察和氧气探针/化学探针观察等。图5.体外动态生物被膜培养方法（管式培养法）4.2.1.1实验材料：a.15mL无菌摇菌管；b.长50cm，内直径1.0mm硅胶管（润泽）；c.长2520cm，内直径1.0mm硅胶泵管（润泽）；d.长15cm，内直径1.0mm硅胶管（润泽）；e.长10cm，内直径3.2mm硅胶管（润泽）；f.长30cm，内直径1.0mm硅胶泵管（润泽）；g.等径直通接头（润泽）；h.变径直通接头（润泽）；i.鲁尔接头（润泽）；j.2个2L玻璃培养瓶；k.10%LB培养基（可按需使用其他培养基）；l.过滤器（过滤孔0.22μm）；m.蠕动泵（aperistalticpump，MasterFlex）；n.所需菌株；o.医用尖锐物处理容器；p.75%酒精；q.镊子；r.5mL及1mL无菌针管；s.无菌针头；t.移液器；u.无菌移液管。4.2.1.2培养步骤【附录以protocol/SOP模式进行详细阐述】首先将装有培养基的玻璃培养瓶、硅胶管、除泡器和镊子在121℃高温高压灭菌15分钟，取出并将硅胶管、除泡器和镊子干燥备用。如图一所示，在无菌操作台中按顺序用安装双向接头的硅胶管b连接装有培养基的玻璃培养瓶、无阻泵、过滤器、硅胶管c、d、e、f，2L废液罐，同个装置内至少三个平行（图内展示一个平行），将整个系统置于恒温培养箱内。将目标菌株接种至适当体积的LB培养基中，在所需温度下200rpm摇晃培养过夜。在无菌操作台中，用新鲜LB培养基将菌液稀释至OD600nm=0.1，用无菌针管吸入2mL稀释菌液，并将稀释菌液分别注入硅胶管b平行装置中，用硅胶封口后静置培养2小时使细菌细胞粘附于管壁,用10%LB流动培养基培养3至7天，建立生物被膜。首先将生物被膜管式培养装置进行灭菌和组装，在用药组的培养基玻璃瓶中加入工作浓度的目标抗生素并混合均匀；在阳性对照组的培养基玻璃瓶中加入已知具有抑菌抑生物被膜浓度的粘菌素colistin并混合均匀；在阴性对照组的培养基玻璃瓶中加入等体积的用药组抗生素的溶剂并混合均匀。用药组、阳性对照组和阴性对照组均按照附录X的培养步骤进行接种、培养（附录Xe），后收集生物被膜进行观察。4.2.1.3技术要点a.所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染;b.使用针管与针头吸取菌液后，针头不可朝向操作人，不可盖回针头盖子，以免误伤操作人员；c.将使用过的针管与针头丢弃入医用尖锐物处理容器统一处理，避免误伤操作人员；d.保证无阻泵运行速度一致，避免液体回流造成污染；e.保证硅胶管管壁厚度适宜，造成管壁破裂，影响生物被膜形成；f.在培养过程中如需添加培养基，须用酒精消毒瓶口与邻近装置表面，避免污染；g.培养瓶口须用透气封口膜密封防止培养基蒸发。4.2.2池式培养法（flow-cellbiofilm）适用范围：池式生物被膜培养法通常适用于以下场景：（1）需要实时观察生物被膜形态的相关研究，（2）需要实时观察生物被膜中标记蛋白/基因表达及分布的相关研究，（3）需要实时观察生物被膜群落中不同菌种相对位置关系的研究等。针对池式培养的生物被膜的分析方法主要包括：死活菌细胞染色法（章节5.2）、激光共聚焦荧光显微镜观测法（章节5.6）、3D荧光成像定性定量法（章节5.5）等。以下示意装置和操作均以铜绿假单胞菌（PA）为模式菌株，在耗氧培养条件下进行示例：池式生物被膜培养法通常适用于以下场景：（1）图6.体外动态生物被膜培养方法（池式培养法）4.2.2.1　实验材料：a.15mL无菌摇菌管；b.三通道培养池（3-channelflow-cell）与树脂盖；c.盖玻片；d.硅胶胶水;e.长50cm，内直径1.0mm硅胶管；f.长25cm长20cm，内直径1.0mm硅胶泵管，双端安装；g.长15cm，内直径1.0mm硅胶管；h.长30cm，内直径1.0mm硅胶泵管；i.等径直通接头；j.鲁尔接头；k.2个2L玻璃培养瓶；l.10%LB培养基（可按需使用其他培养基）；m.过滤器（过滤孔0.22μm）；n.蠕动泵（aperistalticpump）；o.所需菌株；p.医用尖锐物处理容器；q.75%酒精；r.镊子；s.5mL及1mL无菌针管；t.无菌针头；u.移液器；v.无菌移液管。4.2.2.2培养步骤【附录以protocol/SOP模式进行详细阐述】首先将生物被膜池式培养装置进行灭菌和组装，在用药组的培养基玻璃瓶中加入工作浓度的目标抗生素并混合均匀；在阳性对照组的培养基玻璃瓶中加入已知具有抑菌抑生物被膜浓度的粘菌素colistin并混合均匀；在阴性对照组的培养基玻璃瓶中加入等体积的用药组抗生素的溶剂并混合均匀。用药组、阳性对照组和阴性对照组均按照附录X的培养步骤进行接种、培养（附录Xf），后收集生物被膜进行观察。4.2.2.3技术要点a.所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染;b.使用针管与针头吸取菌液后，针头不可朝向操作人，不可盖回针头盖子，以免误伤操作人员；c.将使用过的针管与针头丢弃入医用尖锐物处理容器统一处理，避免误伤操作人员；d.保证无阻泵运行速度一致，避免液体回流造成污染；e.保证培养池翻转状态，以免影响生物被膜形成；f.黏结培养池与池盖时须小心不可将池盖压破，并须保证培养池与池盖完全密封，避免菌液与培养基溢出造成污染；g.保证培养池所有通道畅通，避免堵塞造成液体回流与污染；h.在培养过程中如需添加培养基，须用酒精消毒瓶口与邻近装置表面，避免污染；i.培养瓶口须用透气封口膜密封防止培养基蒸发。