免疫共沉淀检测：揭示蛋白质相互作用的秘密

检测方法

• 非变性裂解法：使用含NP-40或Triton X-100的温和裂解液提取总蛋白以保留天然相互作用。
• 抗体孵育捕获法：将特异性抗体加入细胞裂解液中使其与靶抗原形成免疫复合物。
• Protein A/G琼脂糖珠沉淀法：利用珠子结合抗体Fc段将免疫复合物从溶液中固相化分离。
• 预清除处理法：使用空白琼脂糖珠或非特异性IgG预孵育裂解液以降低非特异性背景。
• 梯度洗涤法：通过逐级增加洗涤缓冲液的盐浓度或去垢剂浓度去除非特异性结合蛋白。
• SDS加热洗脱法：使用含SDS和β-巯基乙醇的上样缓冲液煮沸以彻底解离免疫复合物。
• 甘氨酸酸性洗脱法：利用低pH值甘氨酸溶液温和洗脱保留抗体活性以满足后续分析。
• Western Blot验证法：通过SDS-PAGE电泳分离洗脱蛋白并转膜用特异性抗体检测互作蛋白。
• 化学交联共沉淀法：加入可逆交联剂固定瞬态或弱相互作用后再进行常规免疫沉淀操作。
• 核质分离共沉淀法：通过差速离心分离亚细胞组分后分别进行免疫沉淀以明确互作位点。
• 银染质谱联用法：对洗脱复合物进行银染评估纯度后切胶进行质谱鉴定未知互作蛋白。

检测信息

免疫共沉淀检测：揭示蛋白质相互作用的秘密是一种以抗体和抗原专一性作用为基础，用于测定两种目标蛋白质在特定细胞内是否存在生理性相互作用的生化检测方法，广泛应用于分子生物学、细胞生物学及药物靶点筛选领域。

该检测的主要目的在于验证两种或多种蛋白质在体内是否形成复合物，技术手段涉及非变性裂解液处理细胞以保留蛋白质间天然相互作用，随后通过特异性抗体捕获靶蛋白并利用Protein A/G琼脂糖珠进行免疫复合物沉淀。

核心检测流程包括细胞裂解、抗原抗体孵育、珠子捕获、洗涤非特异性结合物及洗脱免疫复合物，很终通过Western Blot或质谱法对共沉淀下来的互作蛋白进行定性鉴定与分子量验证。

常见问题

免疫共沉淀检测：揭示蛋白质相互作用的秘密检测需要多长时间？

通常7-15个工作日，具体周期视细胞培养状态、抗体亲和力及下游Western Blot验证结果而定，复杂样本可能需要延长时间。

免疫共沉淀检测：揭示蛋白质相互作用的秘密检测费用大概多少？

根据检测项目数量确定，单次互作验证与多组复合物分析的成本存在差异，需结合具体抗体来源及质谱鉴定需求进行核算。

免疫共沉淀检测：揭示蛋白质相互作用的秘密检测报告有什么用途？

可用于质量评估、项目验收，中析研究所检测中心出具的测试数据可用于科研论文发表支持及基金课题结题证明。

免疫共沉淀检测中如何降低非特异性结合背景？

可通过增加洗涤缓冲液中氯化钠的浓度、加入适量去垢剂如Tween-20，或使用预清除反应去除与Protein A/G琼脂糖珠非特异性结合的杂蛋白来降低背景。

检测范围

• 内源性蛋白质相互作用验证
• 外源性过表达蛋白互作分析
• 转录因子与辅激活因子结合检测
• 激酶与底物特异性识别测定
• 受体与配体结合复合物分离
• 泛素化修饰蛋白互作验证
• 乙酰化依赖性蛋白结合检测
• 支架蛋白复合物组装分析
• 细胞周期调控蛋白相互作用测定
• 信号传导通路蛋白级联互作验证
• 病毒蛋白与宿主细胞蛋白结合检测
• 肿瘤抑制蛋白复合物形成分析
• 细胞凋亡相关蛋白网络互作测定
• 核内受体与共抑制因子结合验证
• 膜蛋白复合物相互作用分析
• 骨架蛋白结合特异性检测
• RNA结合蛋白与互作因子复合物测定
• 伴侣蛋白与底物折叠中间体结合验证
• 染色质重塑复合物亚基互作分析
• 翻译起始因子复合物组装验证
• 金属离子依赖性蛋白互作测定

检测标准（部分）

• GB/T 19495.8-2004 转基因产品检测 蛋白质检测方法
• JB/T 12964-2016 牛奶·奶粉蛋白质快速检测仪
• GB/T 41366-2022 畜禽肉品质检测 水分、蛋白质、脂肪含量的测定 近红外法
• DB22/T 2002-2014 牛奶和奶粉中蛋白质快速检测仪
• 农业部2406号公告-5-2016 转基因生物及其产品食用安全检测外源蛋白质致敏性人血清酶联免疫试验
• 农业部2031号公告-15-2013 转基因生物及其产品食用安全检测蛋白质功效比试验
• DB12/T 347-2007 小麦、玉米粗蛋白质含量近红外快速检测方法
• 农业部2406号公告-10-2016 转基因生物及其产品食用安全检测蛋白质急性经口毒性试验
• 农业部2630号公告-12-2017 转基因植物及其产品成分检测 外源蛋白质检测试纸评价方法
• 农业部2031号公告-17-2013 转基因生物及其产品食用安全检测蛋白质热稳定性试验
• 农业部2630号公告-16-2017 转基因生物及其产品食用安全检测 外源蛋白质与毒性蛋白质和抗营养因子的氨基酸序列相似性生物信息学分析方法
• 农业部2406号公告-4-2016 转基因生物及其产品食用安全检测蛋白质7d经口毒性试验
• 农业农村部公告第323号-26-2020 转基因生物及其产品食用安全检测 外源蛋白质大鼠28天经口毒性试验
• 农业部2031号公告-18-2013 转基因生物及其产品食用安全检测蛋白质糖基化高碘酸希夫染色试验
• YY/T 0616.7-2020 一次性使用医用手套　第7部分：抗原性蛋白质含量免疫学测定方法
• 农业部1782号公告-12-2012 转基因生物及其产品食用安全检测 蛋白质氨基酸序列飞行时间质谱分析方法
• DIN EN ISO 21572:2020-02 Foodstuffs - Molecular biomarker analysis - Immunochemical methods for the detection and quantification of proteins (ISO 21572:2019)
• 农业农村部公告第423号-1-2021 转基因生物及其产品食用安全检测 模拟胃液和模拟肠液中外源蛋白质消化稳定性试验方法
• 农业部1485号公告-17-2010 转基因生物及其产品食用安全检测 外源基因异源表达蛋白质等同性分析导则
• 农业部1485号公告-18-2010 转基因生物及其产品食用安全检测 外源蛋白质过敏性生物信息学分析方法

检测项目

• 靶蛋白表达水平验证：通过Input组检测确认裂解液中目标蛋白丰度足够，避免假阴性判定。
• 抗体特异性验证：检测免疫沉淀所用抗体是否能够特异性识别靶蛋白而不结合非特异性抗原。
• 非特异性结合背景测定：使用IgG对照组评估琼脂糖珠或抗体本身对杂蛋白的非特异性吸附程度。
• 互作蛋白定性分析：通过Western Blot鉴定共沉淀下来的伴侣蛋白分子量以确认互作关系。
• 蛋白质复合物洗脱效率：评估SDS上样缓冲液或甘氨酸洗脱液对免疫复合物的解离能力。
• 复合物稳定性测试：在不同洗涤盐浓度下测定蛋白复合物的解离常数以评估结合强度。
• 去垢剂耐受性分析：检测非离子型去垢剂浓度对蛋白复合物天然构象保留的影响。
• Protein A/G珠子结合能力：测定琼脂糖珠对抗体Fc段的饱和结合量以优化试剂比例。
• 共沉淀富集倍数计算：对比Input与IP组中互作蛋白的信号强度比值以量化富集效果。
• 蛋白翻译后修饰互作检测：验证磷酸化或泛素化修饰是否为介导蛋白质相互作用的关键因素。
• 细胞裂解完全度评估：通过显微镜观察及BCA定量判定细胞破碎及蛋白释放效率。
• 蛋白酶抑制效率测定：确认裂解液中PMSF等抑制剂有效防止了靶蛋白降解。
• 动态相互作用时间曲线：在不同刺激时间点取样检测蛋白复合物组装的动态变化。
• 核质分离互作定位检测：分别提取细胞质与细胞核组分进行免疫沉淀以确定互作发生空间。
• 反向免疫共沉淀验证：交换抗体捕获靶点对互作关系进行正反向双重验证以排除假阳性。
• 交联剂稳定化效果评估：使用DSP或DSS交联剂检测瞬态或弱相互作用蛋白的捕获效率。
• 洗脱物纯度测定：通过银染或考马斯亮蓝染色评估洗脱组分的杂蛋白残留情况。
• 温度敏感互作分析：在4℃与室温条件下对比检测蛋白复合物的热稳定性差异。
• 离子强度依赖性分析：通过梯度氯化钠浓度测试静电作用在蛋白互作中的贡献比例。
• 复合物化学计量比初探：通过灰度值分析初步推算互作蛋白在复合物中的摩尔比例。

总结

免疫共沉淀检测：揭示蛋白质相互作用的秘密是测定生理状态下蛋白质相互作用的生化检测，覆盖复合物验证等内容。中析研究所检测中心报告可用于项目验收，周期为7至15个工作日。