实时PCR检测

实时PCR检测检测项目

• 核酸提取纯度检测：通过测定A260/A280比值判定核酸样本中蛋白质污染程度，确保后续扩增反应不受抑制。
• 核酸浓度定量分析：利用荧光染料法或紫外分光光度法测定样本初始核酸浓度，为反应体系配制提供基础数据。
• 阳性临界值设定：确定判定样本为阳性的很低荧光信号强度，是定性检测结果判读的关键依据。
• 阴性对照测试：监测反应体系中是否存在核酸污染或非特异性扩增，确保检测结果的可靠性。
• 内标扩增验证：通过检测内参确认核酸提取和扩增过程的有效性，排除假阴性结果。
• Ct值测定：计算荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，用于目标核酸的相当定量和相对定量分析。
• 扩增效率计算：通过标准曲线斜率计算扩增效率，理想范围应在90%至110%之间，以评估反应体系的优化程度。
• 熔解曲线分析：通过缓慢升温监测荧光信号衰减情况，判定扩增产物的特异性，排除引物二聚体干扰。
• 标准曲线线性相关系数评估：计算R2值以验证标准品浓度与Ct值之间的线性关系，要求R2大于0.98以保证定量准确性。
• 很低检测限测定：确定体系能够稳定检出目标核酸的很低拷贝数，是评价方法灵敏度的核心指标。
• 重复性测试：对同一样本进行多次平行检测并计算Ct值的变异系数，评估检测方法的精密度。
• 特异性验证：使用非目标病原体核酸进行扩增测试，确认引物探针仅与目标序列结合，避免交叉反应。
• 表达相对定量分析：通过比较目标与内参的表达差异，分析特定条件下的转录水平变化。
• 拷贝数相当定量：利用已知浓度的标准品换算样本中目标核酸的相当拷贝数，常用于病毒载量评估。
• 耐受性评估：在存在已知PCR抑制剂的样本基质中测试扩增稳定性，评价检测方法的抗干扰能力。
• 多重反应体系优化：在同一反应管中同时检测多个靶，要求不同荧光通道之间无光谱重叠干扰。
• 探针浓度优化：调整荧光探针的用量以获得很大荧光信号增幅，同时降低背景噪音。
• 退火温度优化：通过温度梯度实验确定引物与模板结合的良好温度，提高扩增产物特异性和产率。
• 基线校正参数设定：规范荧光信号收集的基线范围，消除反应早期荧光波动对Ct值计算的影响。
• 阈值循环数精密度测试：评估同一批次不同反应管之间Ct值的波动范围，确保仪器均一性符合检测要求。

检测信息

实时PCR检测是一种通过荧光信号对PCR产物进行实时监测的分子生物学技术，主要用于病原体核酸定性定量分析、表达研究和突变检测等领域。

检测目的在于通过监测扩增循环中荧光强度的变化，实现对目标核酸分子的精准定量与定性判定，涉及荧光探针技术、引物特异性扩增以及熔解曲线分析等技术手段。

检测流程涵盖核酸提取、反转录、反应体系配制、扩增程序设定及数据分析，核心参数包括Ct值、扩增效率、荧光阈值和标准曲线相关系数。

常见问题

实时PCR检测检测需要多长时间？

通常7-15个工作日，具体时间视样本类型、检测项目数量及核酸提取难度而定，加急服务可缩短至3个工作日。

实时PCR检测检测费用大概多少？

根据检测项目数量确定，常规单项核酸定性检测费用在数百元区间，若需进行相当定量分析或多重PCR检测，费用将相应增加。

实时PCR检测检测报告有什么用途？

可用于质量评估、项目验收，中析研究所检测中心可满足监管机构审查和科研数据发表需求。

实时PCR检测对样本采集和运输有什么要求？

样本需使用无菌无核酸酶容器采集，血液样本需分离血清，组织样本需冷冻保存，运输过程需采用干冰或冰袋维持低温，防止核酸降解。

检测范围

• 新型冠状病毒核酸实时PCR检测
• 甲型流感病毒核酸实时PCR检测
• 乙型肝炎病毒核酸实时PCR检测
• 丙型肝炎病毒核酸实时PCR检测
• 病毒核酸实时PCR检测
• 结核分枝杆菌核酸实时PCR检测
• 沙门氏菌核酸实时PCR检测
• 金黄色葡萄球菌核酸实时PCR检测
• 大肠杆菌O157:H7核酸实时PCR检测
• 单增李斯特菌核酸实时PCR检测
• 禽流感病毒核酸实时PCR检测
• 猪瘟病毒核酸实时PCR检测
• 口蹄疫病毒核酸实时PCR检测
• 非洲猪瘟病毒核酸实时PCR检测
• 转大豆成分实时PCR检测
• 转玉米成分实时PCR检测
• 转水稻成分实时PCR检测
• 牛源性成分实时PCR检测
• 羊源性成分实时PCR检测
• 猪源性成分实时PCR检测
• 鸡源性成分实时PCR检测
• 鸭源性成分实时PCR检测

检测标准（部分）

• GB/T 42753-2023 实时荧光定量PCR仪性能评价通则
• GB/T 35904-2018 旋毛虫实时荧光PCR检测方法
• GB/T 38133-2019 转基因苜蓿实时荧光PCR检测方法
• GB/T 40472-2021 柱锈菌科实时荧光PCR检疫鉴定方法
• GB/T 36806-2018 甘蔗杆状病毒实时荧光PCR检测方法
• GB/T 40192-2021 刺盘孢属实时荧光PCR检疫鉴定方法
• GB/T 40254-2021 轮枝菌属实时荧光PCR检疫鉴定方法
• GB/T 36829-2018 甘蔗宿根矮化病菌实时荧光PCR检测方法
• GB/T 28068-2011 柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法
• GB/T 27540-2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法
• GB/T 28067-2011 甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法
• GB/T 27637-2011 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法
• GB/T 27528-2011 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法
• GB/T 27639-2011 结核病病原菌实时荧光PCR检测方法
• JJF(鲁) 138-2022 实时荧光定量 PCR 仪校准规范
• SN/T 5338-2021 虎物种鉴定 实时荧光PCR方法
• SN/T 5558-2022 转基因香石竹（康乃馨）检测 普通PCR和实时荧光PCR法
• JJF(苏) 222-2019 实时荧光定量PCR仪校准规范
• SC/T 3060-2023 鳕鱼品种的鉴定 实时荧光PCR法
• GB/T 22287-2008 贝类中甲型肝炎病毒检测方法 普通 RT-PCR方法和实时荧光 RT-PCR方法

总结

实时PCR检测是针对核酸分子进行定性定量分析的检测，覆盖病原微生物筛查与表达分析等内容。中析研究所检测中心报告可用于质量评估及项目验收，常规周期7至15个工作日。